Nobelovu cenu za chémiu získali Američania Osamu Shimomura, Martin Chalfie a Roger Y. Tsien za objav a využitie zeleného fluorescenčného proteínu GFP.
V prístave Friday Harbor na pobreží štátu Washington prišli v júni roku 1961 o život desaťtisíce medúz. Odvtedy sa táto udalosť opakovala so železnou pravidelnosťou každé leto počas dlhých dvadsiatich rokov. Páchateľmi tohto, na prvý pohľad nepochopiteľného masakru boli dvaja inak mierumilovní vedci.
Jeden z nich – Osamu Shimomura – získal vďaka zabíjaniu medúz tohtoročnú Nobelovu cenu za chémiu. Spolu s ním ju získali dvaja ďalší páni: Martin Chalfie a Roger Y. Tsien. A za čo ju vlastne títo traja muži dostali? Nuž, každý za niečo iné a zároveň všetci prakticky za to isté.
.prvý: za objav
Zhruba pred polstoročím sa biológ Osamu Shimomura (so „spoluzabijakom“ Frankom Johnsonom) intenzívne zaoberal problematikou bioluminiscencie – teda javu, ktorým živé organizmy prostredníctvom chemických reakcií produkujú svetlo. Obaja vedci sa za každú cenu snažili dozvedieť, ako dokážu bezfarebné a prakticky priehľadné medúzy Aequorea victoria svietiť v morských hlbinách nazeleno (vlastne namodro, ale o tom za chvíľu).
Tieto elegantné bezstavovce majú tvar polguľovitého dáždnika, v priemere merajú 5-10 centimetrov a vážia asi 50 gramov. Ich svetelné orgány predstavuje zhruba sto granúl veľkosti makových zrniečok, ktoré sú rovnomerne rozmiestené po celom obvode „klobúka“. Shimomura objavil, že tie malinké medúzie „lampášiky“ obsahujú dovtedy neznámu bielkovinu a nazval ju aequorín.
Vysvitlo, že táto molekula má výnimočnú schopnosť uvoľňovať značné množstvo energie vo forme modrého svetla. Avšak iba vtedy, ak je vystavená pôsobeniu vápenatých katiónov. A Shimomura zistil aj druhú zásadnú vec: na svetielkovanie medúzy nazeleno je okrem aequorínu potrebná ešte jedna biochemická „súčiastka“ – zelený fluorescenčný proteín (GFP). Nuž, a práve GFP je spoločným leitmotívom udelenia tohtoročnej Nobelovej ceny za chémiu.
Shimomura ho ako prvý na svete izoloval a zároveň popísal, ktoré časti tejto „zázračnej“ molekuly sú zodpovedné za bioluminiscenciu. Ako vlastne celý proces funguje? Veľmi zjednodušene tak, že najprv sa ióny vápnika naviažu na aequorín, v dôsledku čoho táto bielkovina vyžiari modré svetlo. Uvoľnená energia je vzápätí zachytená proteínom GFP a prostredníctvom neho premenená na finálnu zelenú fluorescenciu medúzy.
Shimomurov objav odštartoval menšiu revolúciu v (bio)chémii a molekulárnej biológii, založenú práve na využití vlastností GFP. A čo bolo potrebné urobiť, aby takýto objav vôbec uzrel svetlo sveta? Vlastne celkom jednoduchú vec. Stačilo dve desaťročia loviť medúzy, odkrajovať z nich svetielkujúce časti a snažiť sa z nich izolovať spomínané fotomolekuly.
Aká to však bola sizyfovsky namáhavá práca, ilustruje fakt, že z 50 000 kusov (asi 2,5 tony) medúz sa dalo v najlepšom prípade získať iba pol gramu aequorínu. Shimomura dnes odhaduje, že za celé tie roky výskumu ich musel fyzicky uloviť a spracovať asi milión! Nobelovku si nepochybne zaslúži, tu sa však jeho úloha v príbehu končí, pretože o praktické využitie svojho objavu sa ďalej nezaujímal.
.druhý: za aplikácie
Enormný potenciál GFP, ako vhodného „značkovacieho“ prostriedka na vizualizáciu komplexných biochemických štruktúr a procesov, si ako prvý uvedomil Douglas Prasher. Napadla mu totiž geniálna a pritom veľmi jednoduchá myšlienka: skúsme vložiť gén pre GFP do iného génu, podľa ktorého sa vyrába konkrétna bielkovina, ktorej osud nás zaujíma. Na zvolenú bielkovinu tým pádom „zavesíme“ molekulu GFP, ktorá sa dá zviditeľniť jednoduchým ožiarením ultrafialovým (alebo modrým) svetlom – a príslušný proteín, tkanivo alebo celý orgán v živom organizme sa rozsvietia nazeleno!
Obrovskou výhodou GFP je jeho veľkosť, na proteín je totiž relatívne malý, takže vlastne nijako neovplyvňuje pôvodné funkcie študovanej (a inak neviditeľnej) bielkoviny. Navyše na svoju prácu nepotrebuje žiadne pomocné látky (horčík, vápnik) ako iné fluorescenčné molekuly. Ani geniálny nápad vám však Nobelovu cenu nezaručí. Prasherovi vypršal dvojročný grant a jeho výskum GFP sa zastavil. A to bol jeden z dôvodov, prečo sa nakoniec nestal laureátom tohtoročnej Nobelovej ceny.
Tú dostal Martin Chalfie, ktorý síce začal na výskume aplikácií pracovať až v čase, keď už bola štruktúra GFP génu známa, ale práve jemu sa ako prvému podarilo vložiť tento gén do genómu baktérie Escherichia coli. Nuž, a kolónie takto geneticky pozmenených baktérií po ožiarení modrým svetlom svetielkovali nazeleno. Iróniou osudu je, že vzorky DNA na svoje kľúčové pokusy získal Chalfie práve od smoliara Prashera.
Chalfie ďalej pokračoval vo výskume, vylepšil techniku značkovania génov pomocou GFP a predviedol, že je možné ju úspešne použiť aj u iných organizmov, ako sú baktérie. Takto sa mu podarilo nazeleno „rozsvietiť“ napríklad háďatko Caenorhabditis elegans, obľúbený objekt molekulárnych biológov. Navyše ukázal, že vhodne označkovaný gén u rodiča sa následne prenáša aj na potomstvo, a tak doslova „svieti celá rodina“.
Tieto jeho prevratné výsledky jednoznačne demonštrovali schopnosť GFP fungovať ako univerzálny genetický marker. Zároveň znamenali obrovský progres v oblasti experimentálneho štúdia dynamických procesov živých organizmov.
Medzičasom sa na scéne objavil Sergej A. Lukjanov, ktorý našiel ďalšie fluorescenčné proteíny podobné GFP, tentoraz červené (DsRed, mKate) – a to prosím v morských koraloch a sasankách. Nikto pred ním ich tam ani nehľadal, pretože tieto organizmy bioluminiscenciu vôbec nevykazujú. Za zmienku určite stojí, že Lukjanov neulovil spomínané sasanky v mori, ale si ich jednoducho kúpil v akvaristickom obchode v Moskve. Nobelovku však nedostal.
.tretí: za objasnenie
Jednu Nobelovu cenu si totiž môžu rozdeliť najviac traja a ten tretí bol Roger Y. Tsien. Ten skúmal vlastnosti GFP v neprítomnosti kyslíka a na prekvapenie zistil, že za takýchto podmienok k nijakému zelenému svetielkovaniu nedochádza. Len čo však „udusený“ GFP vystavil pôsobeniu atmosféry s kyslíkom, znovu sa krásne rozžiaril.
Tsienovi teda celkom logicky napadlo, že kyslík zrejme hrá kľúčovú úlohu pri vzniku takej chemickej štruktúry (chromofóru) v rámci molekuly GFP, ktorá je skutočným nositeľom jeho fluorescenčných vlastností. No a keďže kyslík sa prirodzene nachádza vo všetkých živých aeróbnych organizmoch, bolo hneď jasné, prečo GFP svietil v každom jednom, do ktorého sa zatiaľ dostal. A že bude zrejme fungovať presne rovnako vo všetkých ďalších, do ktorých sa ešte len dostane.
Tsien pokračoval vo výskume, navrhol relevantný chemický mechanizmus bioluminiscencie na báze GFP a podarilo sa mu uskutočniť zmeny (bodové mutácie) génu GFP tak, aby cielene ovplyvnil výslednú farbu produkovaného svetla. Týmto spôsobom pripravil celú paletu nových fluoroscenčných proteínov obsahujúcej prakticky všetky farby dúhy. Ukázalo sa, že tieto nové fotomolekuly sú z hľadiska bioluminiscencie dokonalejšie ako samotný GFP, pretože sú oveľa stabilnejšie a po ožiarení podstatne jasnejšie svietia.
Chemici, biológovia a lekári tak dostali do rúk extrémne užitočný nástroj na zviditeľnenie neviditeľného. V rámci jednej jedinej bunky je možné označiť jednotlivé bielkoviny rôznymi farbami a sledovať ich vznik, transport, metabolizmus a zánik doslova na vlastné oči a v reálnom čase. A dokonca niekoľko procesov súčasne. Pričom je jedno, či ide o rast neurónov mozgu, šírenie sa rakovinových buniek pankreasu alebo vývoj embrya laboratórneho zvieraťa. Limitom je v tomto prípade asi len množstvo dostupných farieb a naša fantázia.
Autor je chemik
V prístave Friday Harbor na pobreží štátu Washington prišli v júni roku 1961 o život desaťtisíce medúz. Odvtedy sa táto udalosť opakovala so železnou pravidelnosťou každé leto počas dlhých dvadsiatich rokov. Páchateľmi tohto, na prvý pohľad nepochopiteľného masakru boli dvaja inak mierumilovní vedci.
Jeden z nich – Osamu Shimomura – získal vďaka zabíjaniu medúz tohtoročnú Nobelovu cenu za chémiu. Spolu s ním ju získali dvaja ďalší páni: Martin Chalfie a Roger Y. Tsien. A za čo ju vlastne títo traja muži dostali? Nuž, každý za niečo iné a zároveň všetci prakticky za to isté.
.prvý: za objav
Zhruba pred polstoročím sa biológ Osamu Shimomura (so „spoluzabijakom“ Frankom Johnsonom) intenzívne zaoberal problematikou bioluminiscencie – teda javu, ktorým živé organizmy prostredníctvom chemických reakcií produkujú svetlo. Obaja vedci sa za každú cenu snažili dozvedieť, ako dokážu bezfarebné a prakticky priehľadné medúzy Aequorea victoria svietiť v morských hlbinách nazeleno (vlastne namodro, ale o tom za chvíľu).
Tieto elegantné bezstavovce majú tvar polguľovitého dáždnika, v priemere merajú 5-10 centimetrov a vážia asi 50 gramov. Ich svetelné orgány predstavuje zhruba sto granúl veľkosti makových zrniečok, ktoré sú rovnomerne rozmiestené po celom obvode „klobúka“. Shimomura objavil, že tie malinké medúzie „lampášiky“ obsahujú dovtedy neznámu bielkovinu a nazval ju aequorín.
Vysvitlo, že táto molekula má výnimočnú schopnosť uvoľňovať značné množstvo energie vo forme modrého svetla. Avšak iba vtedy, ak je vystavená pôsobeniu vápenatých katiónov. A Shimomura zistil aj druhú zásadnú vec: na svetielkovanie medúzy nazeleno je okrem aequorínu potrebná ešte jedna biochemická „súčiastka“ – zelený fluorescenčný proteín (GFP). Nuž, a práve GFP je spoločným leitmotívom udelenia tohtoročnej Nobelovej ceny za chémiu.
Shimomura ho ako prvý na svete izoloval a zároveň popísal, ktoré časti tejto „zázračnej“ molekuly sú zodpovedné za bioluminiscenciu. Ako vlastne celý proces funguje? Veľmi zjednodušene tak, že najprv sa ióny vápnika naviažu na aequorín, v dôsledku čoho táto bielkovina vyžiari modré svetlo. Uvoľnená energia je vzápätí zachytená proteínom GFP a prostredníctvom neho premenená na finálnu zelenú fluorescenciu medúzy.
Shimomurov objav odštartoval menšiu revolúciu v (bio)chémii a molekulárnej biológii, založenú práve na využití vlastností GFP. A čo bolo potrebné urobiť, aby takýto objav vôbec uzrel svetlo sveta? Vlastne celkom jednoduchú vec. Stačilo dve desaťročia loviť medúzy, odkrajovať z nich svetielkujúce časti a snažiť sa z nich izolovať spomínané fotomolekuly.
Aká to však bola sizyfovsky namáhavá práca, ilustruje fakt, že z 50 000 kusov (asi 2,5 tony) medúz sa dalo v najlepšom prípade získať iba pol gramu aequorínu. Shimomura dnes odhaduje, že za celé tie roky výskumu ich musel fyzicky uloviť a spracovať asi milión! Nobelovku si nepochybne zaslúži, tu sa však jeho úloha v príbehu končí, pretože o praktické využitie svojho objavu sa ďalej nezaujímal.
.druhý: za aplikácie
Enormný potenciál GFP, ako vhodného „značkovacieho“ prostriedka na vizualizáciu komplexných biochemických štruktúr a procesov, si ako prvý uvedomil Douglas Prasher. Napadla mu totiž geniálna a pritom veľmi jednoduchá myšlienka: skúsme vložiť gén pre GFP do iného génu, podľa ktorého sa vyrába konkrétna bielkovina, ktorej osud nás zaujíma. Na zvolenú bielkovinu tým pádom „zavesíme“ molekulu GFP, ktorá sa dá zviditeľniť jednoduchým ožiarením ultrafialovým (alebo modrým) svetlom – a príslušný proteín, tkanivo alebo celý orgán v živom organizme sa rozsvietia nazeleno!
Obrovskou výhodou GFP je jeho veľkosť, na proteín je totiž relatívne malý, takže vlastne nijako neovplyvňuje pôvodné funkcie študovanej (a inak neviditeľnej) bielkoviny. Navyše na svoju prácu nepotrebuje žiadne pomocné látky (horčík, vápnik) ako iné fluorescenčné molekuly. Ani geniálny nápad vám však Nobelovu cenu nezaručí. Prasherovi vypršal dvojročný grant a jeho výskum GFP sa zastavil. A to bol jeden z dôvodov, prečo sa nakoniec nestal laureátom tohtoročnej Nobelovej ceny.
Tú dostal Martin Chalfie, ktorý síce začal na výskume aplikácií pracovať až v čase, keď už bola štruktúra GFP génu známa, ale práve jemu sa ako prvému podarilo vložiť tento gén do genómu baktérie Escherichia coli. Nuž, a kolónie takto geneticky pozmenených baktérií po ožiarení modrým svetlom svetielkovali nazeleno. Iróniou osudu je, že vzorky DNA na svoje kľúčové pokusy získal Chalfie práve od smoliara Prashera.
Chalfie ďalej pokračoval vo výskume, vylepšil techniku značkovania génov pomocou GFP a predviedol, že je možné ju úspešne použiť aj u iných organizmov, ako sú baktérie. Takto sa mu podarilo nazeleno „rozsvietiť“ napríklad háďatko Caenorhabditis elegans, obľúbený objekt molekulárnych biológov. Navyše ukázal, že vhodne označkovaný gén u rodiča sa následne prenáša aj na potomstvo, a tak doslova „svieti celá rodina“.
Tieto jeho prevratné výsledky jednoznačne demonštrovali schopnosť GFP fungovať ako univerzálny genetický marker. Zároveň znamenali obrovský progres v oblasti experimentálneho štúdia dynamických procesov živých organizmov.
Medzičasom sa na scéne objavil Sergej A. Lukjanov, ktorý našiel ďalšie fluorescenčné proteíny podobné GFP, tentoraz červené (DsRed, mKate) – a to prosím v morských koraloch a sasankách. Nikto pred ním ich tam ani nehľadal, pretože tieto organizmy bioluminiscenciu vôbec nevykazujú. Za zmienku určite stojí, že Lukjanov neulovil spomínané sasanky v mori, ale si ich jednoducho kúpil v akvaristickom obchode v Moskve. Nobelovku však nedostal.
.tretí: za objasnenie
Jednu Nobelovu cenu si totiž môžu rozdeliť najviac traja a ten tretí bol Roger Y. Tsien. Ten skúmal vlastnosti GFP v neprítomnosti kyslíka a na prekvapenie zistil, že za takýchto podmienok k nijakému zelenému svetielkovaniu nedochádza. Len čo však „udusený“ GFP vystavil pôsobeniu atmosféry s kyslíkom, znovu sa krásne rozžiaril.
Tsienovi teda celkom logicky napadlo, že kyslík zrejme hrá kľúčovú úlohu pri vzniku takej chemickej štruktúry (chromofóru) v rámci molekuly GFP, ktorá je skutočným nositeľom jeho fluorescenčných vlastností. No a keďže kyslík sa prirodzene nachádza vo všetkých živých aeróbnych organizmoch, bolo hneď jasné, prečo GFP svietil v každom jednom, do ktorého sa zatiaľ dostal. A že bude zrejme fungovať presne rovnako vo všetkých ďalších, do ktorých sa ešte len dostane.
Tsien pokračoval vo výskume, navrhol relevantný chemický mechanizmus bioluminiscencie na báze GFP a podarilo sa mu uskutočniť zmeny (bodové mutácie) génu GFP tak, aby cielene ovplyvnil výslednú farbu produkovaného svetla. Týmto spôsobom pripravil celú paletu nových fluoroscenčných proteínov obsahujúcej prakticky všetky farby dúhy. Ukázalo sa, že tieto nové fotomolekuly sú z hľadiska bioluminiscencie dokonalejšie ako samotný GFP, pretože sú oveľa stabilnejšie a po ožiarení podstatne jasnejšie svietia.
Chemici, biológovia a lekári tak dostali do rúk extrémne užitočný nástroj na zviditeľnenie neviditeľného. V rámci jednej jedinej bunky je možné označiť jednotlivé bielkoviny rôznymi farbami a sledovať ich vznik, transport, metabolizmus a zánik doslova na vlastné oči a v reálnom čase. A dokonca niekoľko procesov súčasne. Pričom je jedno, či ide o rast neurónov mozgu, šírenie sa rakovinových buniek pankreasu alebo vývoj embrya laboratórneho zvieraťa. Limitom je v tomto prípade asi len množstvo dostupných farieb a naša fantázia.
Autor je chemik
Ak ste našli chybu, napíšte na web@tyzden.sk.